ไนโตรซามีน (nitrosamines) หรือ N-nitroso compounds (NOCs) เป็นกลุ่มสารเคมีที่มีความสามารถในการทำลายพันธุกรรมนำไปสู่การกลายพันธุ์ของยีน และการเจริญเติบโตของเนื้องอก (gene mutation and tumour growth)1 โดยโครงสร้างพื้นฐานของสารประกอบไนโตรซามีนประกอบไปด้วยหมู่ไนโตรโซ (nitroso group, -N=O) หรือที่เรียกว่า Nitrosating agent สร้างพันธะกับอะตอมของไนโตรเจนในหมู่เอมีน (amine) เกิดเป็นสารไนโตรซามีน มีสูตรโครงสร้างทั่วไปคือ R1N(R2)N=O

สารประกอบไนโตรซามีนถูกพิจารณาจากองค์กรระดับโลกหลายแห่ง อาทิ องค์การอนามัยโลก (WHO) องค์กรวิจัยมะเร็งระหว่างประเทศ (IARC) และสถาบันพิษวิทยาแห่งชาติสหรัฐอเมริกา (NTP) ว่าเป็นสารที่ “น่าจะก่อมะเร็งในมนุษย์” ดังนั้น การปนเปื้อนของไนโตรซามีนในปัจจุบันจึงไม่ได้เป็นเพียงปัญหาในภาคอุตสาหกรรมใดอุตสาหกรรมหนึ่ง แต่เป็นประเด็นที่ครอบคลุมตั้งแต่สิ่งแวดล้อม น้ำดื่ม เครื่องสำอาง ไปจนถึงผลิตภัณฑ์สุขภาพ และอาหารที่มนุษย์บริโภคอยู่เป็นประจำ

• Nitrosamines เกิดขึ้นได้อย่างไร

ในอุตสาหกรรมยา มีการปรับปรุงกระบวนการผลิตยาในกลุ่มรักษาความดันโลหิตสูง (Sartans) โดยได้นำสารเคมีโซเดียมไนไตรต์ (NaNO2) มาใช้ในการสังเคราะห์วงแหวนเตตราโซล (tetrazole ring) ร่วมกับการใช้ตัวทำละลาย Dimethylformamide (DMF) ภายใต้สภาวะกรด และการให้อุณหภูมิแก่ปฏิกิริยา สามารถทำให้ DMF สลายตัวให้ Dimethylamine ซึ่งจะทำปฏิกิริยากับไนไตรต์ (NO2) เกิดเป็นสารประกอบไนโตรซามีนชนิด N-Nitrosodimethylamine (NDMA) ได้ทันที1 ทำให้เกิดการเรียกคืนยาในกลุ่มนี้ ทั้งในระดับสากลและในประเทศไทย

นอกจากนี้ การตรวจวิเคราะห์สารประกอบไนโตรซามีนได้ขยายผลไปยังยาตัวอื่นๆ ในกลุ่มเดียวกัน ได้แก่ Losartan, Irbesartan, Candesartan และ Olmesartan ซึ่งพบการปนเปื้อนของไนโตรซามีนชนิดอื่นร่วมด้วย เช่น N-Nitrosodiethylamine (NDEA) และ N-Nitroso-N-methyl-4-aminobutyric acid (NMBA)2 อีกทั้งยังมีการตรวจวิเคราะห์ Ranitidine (ยาลดกรดในกระเพาะอาหาร) เกิดการสลายตัวให้ NDMA ได้เองเมื่อได้รับความร้อน และ Metformin (ยารักษาโรคเบาหวาน) ที่มาจากวัตถุดิบ และการปนเปื้อนในกระบวนการผลิต1

และนอกเหนือจากผลิตภัณฑ์ยาแล้วนั้น อุตสาหกรรมอาหารโดยเฉพาะในกลุ่มของเนื้อสัตว์แปรรูป อาทิเช่น ปลาร้า แหนม กุนเชียง ไส้กรอก และเบคอน มีโอกาสสูงที่จะพบการปนเปื้อนของสารประกอบไนโตรซามีนที่มาจากการใช้สารไนไตรต์ และไนเตรตเพื่อถนอมอาหาร และแต่งสีในปริมาณที่สูงเกินความจำเป็น

หน่วยงานกำกับดูแลและรับผิดชอบ อาทิ Food and Drug Administration (FDA) และ European Medicines Agency (EMA) - European Union (EMA) ได้ออกกฎระเบียบให้ผู้ผลิตยาทำการประเมินความเสี่ยงและทดสอบผลิตภัณฑ์เพื่อตรวจหาการปนเปื้อนของไนโตรซามีนอย่างสม่ำเสมอ อีกทั้ง USP และ BP Pharmacopoeia ได้มีการกำหนดแนวทางในการทดสอบสารกลุ่มไนโตรซามีนที่มีโอกาสพบการปนเปื้อนในยาได้ ภายใต้บทกำกับ Nitrosamine Impurities USP <1469> และ N-Nitrosamines in active substances EP 2.5.42 ผ่านการทดสอบสารไนโตรซามีนโมเลกุลเล็ก ประกอบด้วย NDMA, NDEA, NMBA, NDIPA, NEIPA และ NDBA

• Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities (NDSRIs)

NDSRIs หรือ Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities คือสารไนโตรซามีนที่มีโครงสร้างคล้ายคลึงกับตัวยาสำคัญ (API)5 สารเหล่านี้มักเกิดจากการที่ตัวยาสำคัญที่มีหมู่เอมีนทุติยภูมิ (secondary amine) หรือเอมีนตติยภูมิ (tertiary amine) อยู่แล้วในโครงสร้างโมเลกุลยา และทำปฏิกิริยากับ Nitrosating agent ในระหว่างกระบวนการผลิตหรือการเก็บรักษา7 ซึ่งแตกต่างจากไนโตรซามีนขนาดเล็กทั่วไป (small-molecule nitrosamines) เช่น NDMA หรือ NDEA

ตัวอย่างสำคัญ คือ การตรวจพบ N-nitroso-varenicline ในยารักษาอาการติดบุหรี่ และ N-nitroso-sitagliptin ในยารักษาเบาหวาน ปัญหาสำคัญประการหนึ่งคือขาดข้อมูลความเป็นพิษ (toxicity data) สำหรับสารเหล่านี้ เนื่องจากเป็นสารปนเปื้อนชนิดใหม่ที่เพิ่งถูกค้นพบ ทำให้การกำหนดเกณฑ์การยอมรับระดับที่ยอมรับได้ต่อวัน หรือ Acceptable Daily Intake: ADI ทำได้ยาก หน่วยงานกำกับดูแลอย่าง US FDA และ EMA ได้นำแนวทางที่เรียกว่า "Carcinogenic Potency Categorization Approach" (CPCA) มาใช้ เพื่อประเมินระดับความรุนแรงของการก่อมะเร็ง โดยพิจารณาจากความสัมพันธ์ระหว่างโครงสร้างทางเคมี และกิจกรรม (Structure-Activity Relationship: SAR) ของ "Activate structures" ที่เพิ่มความแรง และ "Deactivate structures" ที่ลดความแรงในการก่อมะเร็ง แล้วจัดกลุ่มออกเป็น 5 หมวดความแรง โดย Category 1 (อันตรายสูงสุดหรือมีค่า ADI ต่ำสุด) ไปจนถึง 5 (อันตรายน้อยสุดหรือมีค่า ADI มากสุด)

แนวทาง CPCA นี้ถือเป็นทางออกที่ช่วยให้อุตสาหกรรมยาสามารถดำเนินการต่อไปได้โดยไม่ต้องรอผลการทดสอบในสัตว์ทดลองซึ่งต้องใช้เวลานานหลายปี อย่างไรก็ตาม ผู้ผลิตยาในประเทศไทยจำเป็นต้องศึกษาแนวทางนี้อย่างลึกซึ้ง เพื่อใช้ในการประเมินความปลอดภัยของทะเบียนตำรับยาที่มีอยู่ในความครอบครอง โดยเฉพาะยากลุ่มที่มีหมู่เอมีนในโมเลกุล ซึ่งถือเป็น กลุ่มเสี่ยงสูงต่อการเกิด NDSRIs

• มาตรฐานและความไวในการตรวจวัดจากเทคโนโลยีการวิเคราะห์ขั้นสูง

การวิเคราะห์ไนโตรซามีนเป็นหนึ่งในงานด้านเคมีวิเคราะห์ที่มีความท้าทาย เนื่องจากต้องการ "ความไว" (sensitivity) ในระดับการวิเคราะห์สารปริมาณน้อยมาก หรือ Trace level อีกทั้งยังต้องการ "ความถูกต้อง" (accuracy) สูง ท่ามกลางตัวอย่างที่มีสิ่งรบกวนจำนวนมหาศาล ด้วยเหตุนี้ เทคนิคที่นิยมนำมาใช้ในการวิเคราะห์ปัจจุบันคือเทคนิคโครมาโทกราฟี (chromatography) ร่วมกับแมสสเปกโทรเมทรี (mass spectrometry)

1. Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)
LC-MS/MS เป็นเครื่องมือที่นิยมใช้มากที่สุดในการวิเคราะห์ไนโตรซามีนในผลิตภัณฑ์ยา เนื่องจากสามารถวิเคราะห์สารที่มีความซับซ้อนและระเหยยาก (non-volatile) อย่าง NDSRIs ได้อย่างถูกต้องและแม่นยำ ระบบการวิเคราะห์นี้ทำงานโดยใช้หลักการ Multiple Reaction Monitoring (MRM) ซึ่งจะเลือกวิเคราะห์ค่าสัญญานเฉพาะมวลของโมเลกุลตั้งต้น (parent ion) และมวลของชิ้นส่วนที่แตกตัวออกมา (product ion) ทำให้มีความจำเพาะเจาะจงสูงสุดแม้จะอยู่ในเมทริกซ์ยาที่มีตัวยาสำคัญเข้มข้นสูง ขีดจำกัดในการวัดเชิงปริมาณ (LOQ) ของ LC-MS/MS ในปัจจุบันสามารถลงไปได้ต่ำกว่า 1 ppb

2. Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS/MS)
GC-MS/MS ยังคงเป็นทางเลือกหลักสำหรับการวิเคราะห์ไนโตรซามีนโมเลกุลขนาดเล็กที่ระเหยง่าย เช่น NDMA, NDEA และ NDBA อย่างไรก็ตาม ข้อควรระวังสำคัญคือการใช้ความร้อนสูงในหัวฉีดของ GC อาจทำให้เกิด "Artifacts" หรือการสร้างไนโตรซามีนขึ้นมาใหม่ระหว่างการวิเคราะห์หากในตัวอย่างมีสารตั้งต้นและไนไตรต์หลงเหลืออยู่ การวิเคราะห์จึงต้องมีการเติมสารยับยั้งปฏิกิริยา (quenching agent) และควบคุมอุณหภูมิอย่างเหมาะสม

3. High-Resolution Mass Spectrometry (HRMS)
เทคนิคอย่าง LC-QTOF หรือ LC-Orbitrap ถูกนำมาใช้เมื่อต้องการยืนยันโครงสร้างของไนโตรซามีนที่ยังไม่เป็นที่รู้จัก (unknown impurities) หรือใช้ในการวิเคราะห์ที่ต้องการความแม่นยำของมวล (mass accuracy) ในระดับทศนิยม 4 ตำแหน่ง HRMS ช่วยให้สามารถแยกแยะระหว่างไนโตรซามีนกับสารรบกวนที่มีมวลใกล้เคียงกันได้ดีกว่าเครื่อง Triple quadrupole ทั่วไป

• ความท้าทายจากเมทริกซ์ และการแก้ปัญหาในงานวิเคราะห์

"Matrix effect" หรืออิทธิพลของส่วนประกอบอื่นๆ ในตัวอย่างที่ส่งผลต่อสัญญาณการตรวจวัด คืออุปสรรคใหญ่ที่นักวิเคราะห์ต้องเจอและแก้ปัญหา

ในอุตสาหกรรมยา ตัวยาสำคัญ (API) มักจะมีความเข้มข้นที่สูงกว่าสารปนเปื้อนไนโตรซามีนนับล้านเท่า ทำให้เกิดภาวะ "Signal suppression" หรือการลดทอนการเกิดไอออนในเครื่องแมสสเปกโทรเมทรี การจัดการกับปัญหาเหล่านี้สามารถทำได้หลายวิธี ประกอบด้วย

1. การเลือกใช้ Internal Standard (IS) ที่เหมาะสม การใช้สารมาตรฐานที่ติดฉลากด้วยไอโซโทป (isotopically labeled internal standards) เช่น NDMA-d6 หรือ NDEA-d10 สามารถชดเชยความสูญเสียในระหว่างการเตรียมตัวอย่างและชดเชย Matrix effect ในเครื่อง MS ได้อย่างสมบูรณ์ เนื่องจากสารเหล่านี้มีคุณสมบัติทางเคมีเหมือนกับไนโตรซามีนเป้าหมายทุกประการ เพียงแต่มีมวลต่างกันเท่านั้น

2. การเลือกใช้สารมาตรฐานที่เหมาะสมสำหรับงานการวิเคราะห์เชิงปริมาณ พิจารณาเลือกใช้สารมาตรฐานอ้างอิง (reference material) จากผู้ผลิตที่ได้รับการรับรอง ISO 17034 โดยลักษณะของสารมีความเป็นเนื้อเดียวกัน (authentic uniform material) และมีความบริสุทธิ์สูง ที่มาพร้อมกับเอกสารรับรองคุณภาพ (Certificate of Analysis, COA) ที่มีการรายงานผลการตรวจสอบเอกลักษณ์, ค่าสิ่งเจือปน และค่าความบริสุทธิ์ของสารมาตรฐานในสภาวะปกติ (assay on as-is) และมีการกำกับวันหมดอายุ พร้อมระบุสภาวะการเก็บรักษาสินค้าที่ชัดเจน

3. การเตรียมตัวอย่าง (sample clean-up)การใช้เทคนิค Solid-Phase Extraction (SPE) หรือการสกัดด้วยตัวทำละลายที่มีความจำเพาะ (selective extraction) ช่วยกำจัดโปรตีน ไขมัน และเกลือออกไปก่อนการฉีดเข้าเครื่องมือ ในบางกรณี การเจือจางตัวอย่าง (simple dilution) 10-20 เท่า ก็เพียงพอที่จะลด Matrix effect ลงได้โดยไม่ทำให้ขีดจำกัดการตรวจวัดเสียไป

4. การเลือกใช้อุปกรณ์การวิเคราะห์อย่างเหมาะสมการเลือกใช้คอลัมน์ (column) ที่มีความจำเพาะ เช่น คอลัมน์ที่มี Stationary phase แบบ Biphenyl หรือ Carbon-based จะช่วยให้การแยก NDMA ออกจากส่วนประกอบอื่นของยาทำได้ดีกว่าคอลัมน์ C18 มาตรฐาน

• ห้องปฏิบัติการวิเคราะห์ไนโตรซามีนตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025

เพื่อให้ผลการวิเคราะห์ไนโตรซามีนเป็นที่ยอมรับในระดับสากล และสามารถใช้เป็นหลักฐานทางกฎหมายในการขึ้นทะเบียนตำรับยาหรือการส่งออกอาหารได้ ห้องปฏิบัติการนั้นจะต้องได้รับการรับรองตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025 เพื่อเป็นการยืนยันทั้งระบบการจัดการคุณภาพและความสามารถทางวิชาการของบุคลากร เครื่องมือ และวิธีวิเคราะห์ โดยในประเทศไทยมีห้องปฏิบัติการที่มีศักยภาพและได้รับความเชื่อถือในการวิเคราะห์ไนโตรซามีน ได้แก่ • หน่วยงานรัฐ
กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ (DMSC) สำนักยา และวัตถุเสพติด เป็นหน่วยงานหลักในการวางมาตรฐานและตรวจสอบคุณภาพยา นอกจากนี้ยังมีสถาบันอาหาร (National Food Institute) และกรมประมง ที่ดูแลการวิเคราะห์ในฝั่งของผลิตภัณฑ์อาหาร และประมงส่งออก
• หน่วยงานเอกชน
บริษัทชั้นนำที่มีความเชี่ยวชาญและบริการเครื่องมือระดับสูง เช่น บริษัท เอสจีเอส (ประเทศไทย) จำกัด บริษัท ห้องปฏิบัติการกลาง (ประเทศไทย) จำกัด และบริษัทแล็บเอกชนที่สนับสนุนอุตสาหกรรมเฉพาะทาง เช่น ศูนย์วิทยาศาสตร์เบทาโกร และศูนย์วิจัยของบริษัท เจริญโภคภัณฑ์อาหาร จำกัด (มหาชน)
• สถาบันการศึกษา
ห้องปฏิบัติการในมหาวิทยาลัยชั้นนำ เช่น สถาบันโภชนาการ มหาวิทยาลัยมหิดล มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร์ และมหาวิทยาลัยขอนแก่น

ประเทศไทยเป็นทั้งฐานการผลิตยาสามัญส่งออกหลายประเทศ และเป็นครัวของโลก ปัญหาการปนเปื้อนสารประกอบไนโตรซามีนจึงไม่ได้มีความสำคัญเฉพาะทางเคมีวิเคราะห์เท่านั้น แต่หากเป็นประเด็นที่ส่งผลต่อความเชื่อมั่นในระบบสาธารณสุข และเศรษฐกิจของประเทศไทย การจัดการปัญหาไนโตรซามีนต้องอาศัยความร่วมมือระหว่างภาคเอกชนและภาครัฐในการพัฒนา และเพิ่มขีดความสามารถในการวิเคราะห์ และควบคุมการปนเปื้อนไนโตรซามีนในผลิตภัณฑ์ จะสามารถทำให้ประเทศไทยก้าวขึ้นเป็นผู้นำด้านความปลอดภัยยาและอาหารในระดับภูมิภาคได้อย่างแท้จริง